서론
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성 통성혐기성 구균으로서 자연계에 광범위하게 분포하고 있고 건강한 사람과 동물의 피부, 비강, 인후두부, 털 등에도 상재하고 있어 교차오염에 의해 식품에 쉽게 오염된다. 이 균은 수술 후 창상 감염 및 조직 감염 등을 유발할 뿐만 아니라, 장독소를 생산하므로 대표적인 식중독균으로 알려져 있다(Fetsch & Johler, 2018). S. aureus에 의한 식중독 사고는 매년 꾸준히 발생하고 있으며 최근 10년 동안 우리나라에서 S. aureus에 의해 일어난 식중독 사고 발생 건수는 총 56건, 환자수는 1,391명에 달했다(MFDS, 2025a). 미국에서는 S. aureus 패혈증으로 인해 연간 약 2만 명이 사망한다는 보고가 있다(Turner et al., 2019). 특히 S. aureus에 의해 형성되는 생물막(biofilm)은 환경으로부터의 다양한 스트레스에 대한 저항성이 강해 식품 생산 현장 및 조리 시설에서 제거되지 않아 이에 따른 여러 문제가 발생하고 있다(Lee et al., 2013).
생물막은 항생제를 포함한 다양한 환경적 스트레스에 저항하는 기작으로 세균이 세포 외부에 합성하는 구조체이다. Figure 1과 같이 S. aureus의 생물막 형성 과정은 비생물학적 표면에 소수성 상호작용을 통한 부착(attachment)이나 의료 기기, 식품 제조 기기 등에 부착부터 시작된다. 이후 생물막이 증식(proliferation) 및 성숙(maturation)되는데, 이때 세포와 세포를 부착시키는 다당류나 eDNA (extracellular DNA), 단백질 등이 그 역할을 한다. 계면활성제와 유사한 펩타이드인 PSM(phenol–soluble modulins)이나 분해 분비 효소(nucleases and proteases)는 생물막 분리(detachment)에 관여하며 이렇게 세포군집으로부터 탈착된 세포는 분산(dispersal)됨으로써 박테리아 혈증(bacteremia)과 같은 생물막 관련 감염의 합병증을 유발하는 데에 기여한다(Götz, 2002; Otto, 2018). 특히, 식중독균이 생물막을 형성하면 저항성이 증가하여 항생제를 비롯한 다양한 항균 물질과 기타 제어 기술의 효과가 크게 감소한다. 이에 따라, 최근에는 이미 형성된 생물막을 분해하거나 생물막의 형성을 억제하는 기술에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
S. aureus을 제어하기 위해 그동안은 주로 생장을 저해하고 사멸시키기 위한 온도, 삼투압 및 pH 조절, 자외선, 산화스트레스, 항생제 등의 처리 방식이 사용되어 왔다(Ross et al., 2003; Zhang et al., 2019). 그러나 이미 생물막이 형성되어 있거나 적절한 용법, 용량이 준수되지 못한 경우에는 오히려 가해진 스트레스에 대한 내성이 발생될 수 있으며 특히 항생제 내성(antimicrobial resistance)의 발생은 식품 안전과 더 나아가 국민 보건에 큰 위협을 초래할 수 있어 심각한 문제로 간주된다(Lee et al., 2013; Venkatesan et al., 2015). Methicillin–resistant S. aureus(MRSA)는 미생물 자체의 항생제에 대한 내성 증가 뿐만 아니라 항생제 내성 인자의 전이와 같은 문제를 야기함에도 불구하고, 검출되는 S. aureus 가운데 높은 비율을 차지하고 있다(da Cunha et al., 2020). 또한 가장 효과적으로 사용되어 왔던 페니실린과 메티실린 같은 항생제에 대한 내성 발생으로 인해 S. aureus 감염으로 인한 사망률, 이환율 및 비용을 증가시킬 수 있다(Turner et al., 2019). 따라서 항생제에 대한 내성이 발생할 가능성을 최소화시키기 위해 식중독균의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 환경적 스트레스에 대한 저항성이나 발병에 관련된 인자들의 생산만을 조절하는 새로운 개념의 식중독균 제어 기술을 개발할 필요가 있다.
S. aureus의 독성을 조절하는 정족수 인식(Quorum Sensing, QS) 시스템을 표적으로 하는 치료법은 항생제를 대체할 수 있는 유망한 치료법으로서 각광받고 있다(Le & Otto, 2015). 박테리아 QS 시스템은 고도로 정교한 조절 메커니즘을 사용하여 감염 중 숙주의 변화하는 환경에 따라 독성 유전자의 발현을 조절한다. 병원체 밀도가 낮을 때는 세포 간 통신에 사용되는 신호 분자의 농도가 낮지만, 세포 밀도가 증가하면 역치 농도까지 축적된다. 신호 분자의 농도가 역치에 도달하면 특정 수용체를 통해 세포가 QS 신호 분자를 흡수하고 전사 조절자가 활성화되어 해당 발병 단계에서 필요한 유전자 발현을 유도하거나 억제한다(Kong et al., 2006). S. aureus의 QS 시스템은 생물막 형성과 밀접한 관련이 있으며, 그 중심에는 Agr (accessory gene regulator) 시스템이 있다. Agr 시스템은 특정 펩타이드(autoinducing peptide, AIP) 신호를 통해 세포 밀도를 감지하고, 이에 따라 생물막 분해를 유도하는 계면활성제와 유사한 펩타이드(PSM)의 발현을 증가시킨다(Kong et al., 2006). Vuong 등(2000)에 따르면, 실제로 S. aureus의 agr 의존적인 QS 시스템이 비활성화된 균주에서 생물막 형성이 더 빈번하게 일어남을 보고하였다. 이 사실은 agr 돌연변이와 QS 시스템 차단제를 사용한 agr 시스템 억제를 통해서도 재확인되었다.
본 연구의 목적은 S. aureus의 생물막 형성을 효과적으로 억제하면서도 균의 생장을 저해하지 않아 내성 발생 가능성이 낮은 신규 물질을 발굴하는 데에 있다. 특히 항생제 남용으로 인한 내성균 확산 문제를 해결할 수 있는 대안으로 천연물 유래의 생물막 저해제를 발굴함으로써 기존의 항생제보다 구조적, 기능적 다양성을 확보하고 활성, 안정성, 적용 신뢰성 등은 향상시키고자 하였다. 이를 위해 먼저 천연물 유래 화합물 680종을 대상으로 생물막 형성에 미치는 영향을 분석했다. 이 중에서 유의미하게 생물막 형성을 저해시키는 후보 물질을 선별하여 S. aureus에 대한 생물막 형성 억제능, 이미 형성된 생물막의 분해능, 그리고 S. aureus 생장 억제 여부 등을 평가했다. 이러한 연구 결과는 항생제 내성 유발 없이 S. aureus를 효과적으로 제어할 수 있는 새로운 전략으로 제시될 수 있을 것이며, 기존의 S. aureus 제어 기술과 병행하여 보조적 혹은 대체 처리제로서의 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다. 나아가 내성 발생의 우려가 최소화된 물질은 식품 산업 및 공중보건 분야에서 S. aureus에 의해 발생할 수 있는 다양한 안전상의 문제를 사전 예방하고 해결하는 데에 효과적인 대응 수단이 될 수 있으리라 사료된다.
연구방법
천연물질 및 균주 배양 조건
본 실험에 사용된 천연물질은 한국화학연구원의 한국화합물은행(Korea Chemical bank)에서 분양받은 680종 중 생물막 저해 효과가 확인된 10종이다. 천연물질은 약 1 ~ 5.1 mM 농도 범위로 −80℃ deep freezer에서 보관하며 생물막 저해 효과 탐색에 사용하였다. 사용된 균주는 S. aureus ATCC 25923이며 식품공전 일반시험법에 따라 Luria–Bertani (LB, Difco Inc., Detroit, MI, USA) 배지에서 37℃를 유지하며 정치 배양 또는 200 rpm으로 진탕 배양하였다(Korean Food Code, MFDS, 2025b). 생물막 저해효과 탐색은 1% 포도당(glucose, Junsei Chemical Co., Ltd., Chuo–ku, Tokyo, Japan)을 첨가한 Tryptic Soy Broth(TSB, Difco Inc.) 배지에서 확인하였다(Shrestha et al., 2016).
Daucosterol stock solution 제조
우수한 생물막 형성 억제 효과가 확인된 천연물질 biofilm inhibitor (BI)–70 (daucosterol)은 ChemFaces (ChemFaces Biochemical Co., Ltd., Wuhan, China)에서 구입하였으며, 제조사로부터 순도 98% 이상임을 확인하였다(https://www.chemfaces.com/natural/Daucosterol-CFN98713.html). 희석하기 위해서는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Junsei Chemical Co., Ltd.)에 녹여 10 mM stock을 만든 후 사용하였고 −20℃에서 보관하였다.
천연물질의 S. aureus ATCC 25923에 대한 생물막 형성 억제능 스크리닝
S. aureus ATCC 25923에 대한 천연물질 라이브러리의 생물막 형성 억제능 스크리닝은 Meng 등(2016)의 crystal violet (CV) assay 방법을 통해 확인하였다. S. aureus에 대한 680종 천연물질의 1, 2차 생물막 형성 억제 효과 측정을 통해, 각각 79종과 10종의 천연물질이 선정되었다. 선정된 천연물질 BI 10종의 생물막 형성 억제 효과 측정을 위해 1% glucose가 첨가된 TSB에 S. aureus ATCC 25923을 접종한 후 37℃를 유지하며 16시간 동안 배양했다. 1/100 희석된 배양 균액을 천연물질이 5 μL씩 분주된 96 well–plate에 200 μL씩 접종하였으며, 생물막을 형성시키기 위해 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 24시간 후 균액을 제거하고 phosphate–buffered saline (PBS, pH 7.4) buffer로 3번 씻어냈다. 형성된 생물막을 고정시키기 위해 60℃에서 10분간 건조하였으며, 1.5%(w/v) CV 첨가 후 clean bench에서 30분 동안 염색시켰다. 염색에 이용되고 남은 잔여 CV를 제거하기 위해 PBS buffer로 3번 세척하였으며, 형성된 생물막을 정량하기 위하여 10분간 95% ethanol로 용해시킨 후 UV/VIS spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 595 nm에서 측정했다.
Daucosterol의 농도별 생물막 형성 억제 효과를 확인하기 위해서 DMSO와 다양한 농도의 daucosterol (5, 50, 200, 500, 1,000 μM)이 5 μL씩 분주되어 있는 96 well–plate에 S. aureus ATCC 25923 배양액(1.20 × 105 CFU/mL)을 각 well 마다 195 μL씩 접종하였으며, 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하며 생물막을 형성시켰다. 형성된 생물막 양은 균액 제거 후 1.5%(w/v) CV로 염색하여, 흡광도(optical density, O.D. 595 nm) 측정을 통해 확인하였다.
천연물질의 S. aureus ATCC 25923에 대한 생장 억제 효과 측정
선정된 천연물질 BI 10종의 S. aureus ATCC 25923에 대한 생장 억제 효과를 측정하였다. LB 액체배지에 계대 배양된 S. aureus ATCC 25923의 흡광도(O.D. 600 nm)가 0.8의 log phase(대수기, 9.00 × 108 CFU/mL)일 때, 96 well–plate에 150 μL씩 접종하였다. 천연물질 BI 10종은 각 well에 3 μL씩 첨가하였으며, 대조군으로는 DMSO를 첨가하였다. 96 well–plate는 37℃에서 8시간 동안 배양되었으며, 2시간 간격으로 흡광도를 측정함으로써 천연물질별 생장 억제 효과를 확인하였다.
Daucosterol의 S. aureus ATCC 25923에 대한 생장 억제 효과를 측정하기 위하여 다양한 농도(5, 50, 200, 500, 1,000 μM)의 daucosterol을 대수기의 S. aureus ATCC 25923에 첨가하였으며 대조군으로 DMSO를 첨가하였다. UV/VIS spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 2시간 간격으로 600 nm에서 12시간 동안 농도별 생장 억제 효과를 측정하였다.
S. aureus ATCC 25923에 대한 daucosterol의 생물막 분해 효과 측정
Daucosterol의 생물막 분해 효과 측정은 1% glucose (Junsei Chemical Co., Ltd.)를 첨가한 TSB (Difco Inc.)에서 pre– culture 된 S. aureus ATCC 25923을 1/100 희석하여 96 well–plate에 200 μL씩 분주하였으며, 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하며 생물막을 형성시켰다. 형성된 생물막에 5 μL의 daucosterol (4.9 mM)을 분주하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 균액은 제거되었으며, 남아있는 생물막 양은 형성 억제능 측정과 동일하게 1.5%(w/v) CV 염색 후 흡광도(O.D. 595 nm) 측정을 통해 정량되었다.
통계분석
모든 실험은 3반복 수행되었으며, 결과값은 statistical analysis system (SAS, version 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA) 프로그램의 ANOVA (one–way analysis of variance)를 이용하여 p<0.05 수준에서의 유의성 검정을 실시하였다. 유의한 차이가 있는 경우, Duncan의 다중 범위 검정(Duncan’s multiple range test)을 사후검정으로 수행하였으며, 두 처리 간의 비교가 필요한 경우에는 Student’s t-test를 이용하였다.
결과 및 고찰
천연물질 라이브러리 처리에 따른 S. aureus ATCC 25923의 생물막 형성 억제능 비교
S. aureus ATCC 25923의 생물막은 다양한 스트레스 환경에 대한 내성을 획득하는 데에 기여하며, 이로 인해 육류, 즉석식품, 유제품 등의 식품 표면에 S. aureus의 생장이 촉진되어 위생 문제를 일으킨다(Lee et al., 2013). 이처럼 생물막은 외부환경에 의한 다양한 스트레스로부터 세균을 보호하며, 부유 세포(planktonic cell)에 비해 밀집되어 있어 유전자 전이를 통해 저항성, 새로운 독소의 획득 가능성을 높인다(Jakubowski & Walkowiak, 2015). 따라서 병원성 세균의 생물막을 제어하기 위해 물리, 화학, 생물학적 복합 처리법 등이 보고되고 있다. 가장 일반적으로 사용되고 있는 살균소독제를 활용한 화학적 제어는 독성과 부작용 우려로 인해 천연물질 유래의 생물막 제어제와 같은 대체재 개발 연구의 필요성이 증대되고 있다(Zhao et al., 2017). 본 연구에서는 천연물질 라이브러리 680종을 활용하여 S. aureus의 생물막 형성을 억제할 수 있는 대체재를 찾고자 하였다. 1차, 2차 스크리닝을 통해 선발된 천연물질 BI 10종(BI–3, BI–14, BI–17, BI–22, BI–25, BI–28, BI–30, BI–35, BI–52, BI–70)의 생물막 형성 억제능은 S. aureus ATCC 25923과 천연물질을 함께 정치 배양한 후 DMSO 처리 시와 비교하여 확인하였다. Figure 2A에 따르면 천연물질 BI 10종 처리 시, DMSO 처리에 비해 약 84.15 ~ 96.27% 범위의 통계적으로 유의한 생물막 형성 감소를 나타내었으며, 평균 87.74 ± 3.57% 이상의 뛰어난 생물막 형성 억제 활성을 보였다. 따라서 BI 10종의 천연물질은 S. aureus ATCC 25923의 생물막 형성에 대한 새로운 억제제로서의 가능성을 나타내었다.
BI 10종의 S. aureus ATCC 25923 생장능에 미치는 영향
미생물 사멸을 통한 S. aureus 제어는 내성을 유발하여 더 강한 병원성 세균이 생존하게 되며, 항생제에 대한 감수성 감소로 인해 제어가 어려워져 더 큰 위생적 문제를 야기한다(Cella et al., 2023). 따라서 본 연구에서는 생장 제어가 아닌 생물막과 같은 발병인자를 제어함으로써 항생제 내성 발생 위험이 감소된 미생물 제어기술을 확보하고자 하였다. Figure 2B와 같이 천연물질 BI 10종 처리에 따른 S. aureus ATCC 25923의 생장 억제 효과를 확인한 결과, DMSO와 천연물질을 첨가한 배양액은 37℃에서 8시간 동안 흡광도가 지속적으로 증가하는 양상을 보였다. 특히 BI–14, BI–28, BI–70은 대조구와 비교하여 8시간 동안 유의적인 생장 억제 및 촉진 효과를 나타내지 않았다. 그러나 BI–3과 BI–30은 8시간 동안 지속적인 생장 억제 효과가 나타났으며, 각 천연물질 처리 8시간 후 흡광도 값은 DMSO 그룹에 비하여 약 48.84%와 15.15% 감소되었다. BI–17, BI–35, BI–52 처리 그룹은 초기에는 생장 억제 효과가 약 10.57 ~ 24.58% 수준으로 나타났으나, 8시간 후에는 생장 억제 효과가 나타나지 않았다. 반면, BI–22와 BI–25 처리 그룹에서는 생장 억제 효과가 나타나지 않았을 뿐만 아니라 DMSO 처리 그룹과 비교하여 8시간 동안 약 19.17 ~ 34.92%와 13.46 ~ 31.78% 범위로 지속적으로 S. aureus ATCC 25923의 생장을 촉진시켰다. 이러한 결과는 해당 천연물들이 균의 생장을 오히려 유도하거나 활성화시킬 수 있다는 가능성을 시사한다. 따라서 이들 물질이 세포 대사, 에너지 생성, 또는 성장 인자와 관련된 기전을 통해 S. aureus의 생장에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 추가적인 분자 수준의 분석이 필요할 것으로 사료된다. 또한, 생장 촉진과 생물막 억제 효과가 동시에 나타나는 현상이 장기적으로 어떤 생리학적 또는 병리학적 영향을 미칠 수 있는지, 그리고 이러한 특성이 실제 식품 시스템이나 생물학적 환경에서 어떻게 작용하는지에 대한 후속 연구가 요구된다.
생장 억제 효과가 나타나지 않은 천연물질에 대하여 한국화합물은행에 정보공개를 요청하였으며, 그 중 구매가 가능한 천연 물질인 BI–70을 선정하여 추후 실험에 사용하였다. BI–70은 Figure 3과 같은 구조를 가지는 daucosterol로 밝혀졌으며, 호두의 주 성분이자 약용 식물과를 포함한 다양한 천연물에 존재하는 사포닌으로 알려져 있다(Omari et al., 2022; Zhang et al., 2020). Daucosterol은 항암, 항염증, Th1 면역반응 유도와 같은 효과가 보고된 바 있다(Jang et al., 2019; Zhao et al., 2015; Zingue et al., 2020). 또한 A549 폐암 세포주에 대해서는 증식 억제와 세포 사멸을 유도하는 효능이 있어 치료용 소재로 제안된 바 있다(Rajavel et al., 2017). Daucosterol이 가지는 다양한 건강 기능성에 대한 연구 결과가 다수 보고되었음에도 불구하고 그 동안 anti–biofilm 관련 연구는 보고된 바 없었다.
Daucosterol의 농도별 생장 억제능 측정
Daucosterol의 S. aureus ATCC 25923에 대한 농도별 생장 억제 정도는 흡광도(O.D. 600 nm) 측정을 통해 확인되었고, 그 결과는 Figure 4에 제시하였다. 천연물질이 첨가되지 않은 그룹과 DMSO가 첨가된 S. aureus ATCC 25923 배양액에서 8시간 동안 지속적으로 흡광도가 증가한 것으로 보아 S. aureus ATCC 25923이 정상적으로 배양된 것을 확인할 수 있었다. 다양한 농도의 daucosterol (5, 50, 200, 500, 1,000 μM)이 첨가된 실험군의 흡광도 값은 12시간 동안 DMSO 처리 그룹과 유의한 수준의 차이가 나타나지 않았다. 이를 통해 대수기에서 정지기까지 지속적으로 생장 억제 효과가 나타나지 않는 것을 알 수 있었으며, 1,000 μM의 고농도에서도 생장에 영향을 미치지 않았음을 확인했다.
미생물을 사멸시키기 위해 사용하는 항생제는 선택 압력(selection pressure)를 형성하여 항생제에 민감한 세균은 제거되고 내성을 가진 세균만 생존하게 되는 환경을 조성한다(Abbas et al., 2024). 이러한 선택 압력은 세균이 새로운 내성 기전을 진화시키거나 기존 내성 유전자의 활성화 및 확산을 촉진시켜 결과적으로 더 강한 병원성을 가진 내성균이 생존하게 된다. 따라서 내성 발생 가능성을 낮추기 위해서는 daucosterol과 같이 생장은 억제하지 않고 병원성 인자만을 표적으로 하는 물질의 활용이 중요하다. Sultana와 Afolayan (2007)은 bioautographic assay를 이용하여 daucosterol (0.2 mg/mL)의 항균효과를 확인하였을 때, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella sonnei, S. aureus에 대한 생장 억제 효과가 나타나지 않았다고 보고하였다. de Aguilar 등(2024) 역시 메이테누스 쿼드랑귤라타 잎으로부터 에틸 아세테이트로 추출한 daucosterol을 S. aureus에 처리하였을 때 높은 농도에서도 생장에 영향이 없었다고 보고하였다. 따라서 선행연구 결과와 본 연구의 결과가 일치하며 daucosterol에 의한 내성 발생 가능성은 최소화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
Daucosterol의 생물막 형성 저해 효과
생물막 형성 저해 효과를 확인하기 위해 S. aureus ATCC 25923과 함께 daucosterol을 농도별(5, 50, 200, 500, 1,000 μM)로 처리하며 24시간 정치 배양한 후 형성된 생물막의 양을 확인하였다(Figure 5A). S. aureus ATCC 25923과 대조군으로 S. aureus ATCC 25923에 DMSO를 처리한 그룹에서의 흡광도 값은 각각 1.18 ± 0.10과 1.03 ± 0.12로 확인되었다. 5 μM과 50 μM의 daucosterol을 처리하였을 때 흡광도 값은 각각 0.93 ± 0.05과 0.81 ± 0.15로 DMSO 처리 그룹과 유의적인 차이가 확인되지 않았다. 반면, 200, 500, 1,000 μM의 daucosterol 처리 그룹에서는 각각 0.57 ± 0.19, 0.33 ± 0.09, 0.28 ± 0.04로 DMSO 처리 그룹의 생물막 형성량에 비하여 약 54.84%, 32.29%, 26.87% 유의적 수준의 생물막 형성 억제가 확인되었다 (p<0.05). CV 염색을 통해서 육안으로도 농도 의존적인 생물막 형성 저해 정도를 확인할 수 있었다(Figure 5B). DMSO 처리 그룹과 5 μM, 50 μM의 daucosterol을 처리하였을 때에는 진한 보라색을 띠는 두꺼운 생물막이 형성되었으며 595 nm에서의 흡광도 값(각각 1.03 ± 0.12, 0.93 ± 0.05, 0.81 ± 0.15)을 통해 정량적으로 확인되었다. 반면, 200, 500, 1,000 μM 농도의 daucosterol 처리 시에는 농도가 높아짐에 따라 보라색의 강도가 현저히 감소하여 이에 대응하는 흡광도 값(각각 0.57 ± 0.19, 0.33 ± 0.09, 0.28 ± 0.04)을 고려할 때 생물막 형성이 효과적으로 억제되었음을 알 수 있었다. Vikram 등(2013)은 감귤류로부터 daucosterol과 동일한 phytosterol 계열인 β–sitosterol glucoside를 분리하여 3.125 ~ 100 μM의 범위에서 E. coli O157:H7의 생물막 형성을 억제한다고 보고하였다. 또한 다양한 종류의 식물에서 발견되는 luteolin은 6.98 mM (2 μg/μL)에서부터 통계적으로 유의한 수준으로 생물막 형성 억제능을 나타냈으며, 농도 의존적으로 억제 정도가 증가하다가 13.97 mM (4 μg μL) 처리 시에는 약 86.7%를 억제한다는 것을 Qian 등(2020)의 연구에서 보고하였다. Rahman 등(2017)은 daucosterol이 성분으로 포함된 Amomum tsaoko 추출물을 황색포도상구균에 처리하였을 때, 47.06%의 생물막 저해능을 관찰하였으며 이는 agr 의존성 QS 시스템에 영향을 미쳤기 때문이라 보고했다. 본 연구의 천연물질인 daucosterol은 같은 phytosterol 계열의 물질과 유사하게 생물막 형성 억제능을 나타냈을 뿐만 아니라 luteolin 보다 낮은 농도에서 유의한 수준의 생물막 형성 억제 효과가 확인되었으므로 우수한 생물막 형성 억제제로서의 가능성을 나타냈다.
Daucosterol의 생물막 분해 효과
Daucosterol (4.9 mM)의 S. aureus ATCC 25923에 대한 생물막 분해 효과를 측정한 결과, daucosterol을 처리하였을 때 DMSO가 처리된 대조군에 비하여 약 71.08% 생물막이 감소하여 유의적인 수준의 생물막 분해능이 확인되었다(p<0.001, Figure 6). 반면 S. aureus ATCC 25923과 대조군에서의 흡광도 값은 각각 0.82 ± 0.06와 0.79 ± 0.03로 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 daucosterol이 이미 형성되어 있는 S. aureus ATCC 25923 생물막의 구조를 파괴함을 의미한다.
Rasamiravaka 등(2017)은 phytosterol 계열 물질이 12.5 μM 농도에서 QS–regulated gene인 las의 발현을 저해함으로써 Pseudomonas aeruginosa 가 형성한 생물막에 대한 분해능을 나타냄을 보고하였다. 본 연구에서 발굴된 daucosterol 또한 이미 형성된 S. aureus 생물막의 구조적 안정성을 저해함으로써 분해를 유도할 가능성이 제기된다. 따라서 향후 daucosterol의 생물막 분해 기작에 대한 규명을 위해 S. aureus 생물막 형성 및 유지에 관여하는 핵심 유전자들(icaADBC, sarA, agr, sigB 등)의 발현 변화 및 상호작용을 분석하는 연구가 필요할 것으로 판단된다. 특히, 생물막 형성 억제는 초기 부착이나 세포 간 신호 전달(QS) 경로 차단을 통해 이루어질 수 있으며, 분해 효과는 세포외 다당류(Extracellular polymeric substances, EPS) 생산 감소, matrix 구조 분해 효소 유도, 또는 생리적 스트레스 반응 조절 등의 기전으로 작용할 수 있다. 이러한 생물막 억제 및 분해 메커니즘의 규명은 daucosterol과 같은 천연물 유래 물질의 항생제 대체제로서의 활용 가능성을 과학적으로 뒷받침할 수 있을 것이다.
식품 위해 요소인 생물막을 제어하기 위해 화학적 방법을 지속적으로 사용하였을 때에는 식품에 잔류하게 되어 노출이 연속될 경우 면역 과민반응, 장기 손상 등의 부작용을 일으킬 우려가 있어, 천연 항균물질에 대한 소비자의 요구가 높아진 실정이다(Cho & Park, 2005; Pisoschi et al., 2018). 따라서 본 연구를 통해 발굴된 daucosterol은 식물유래 천연물질로서 세포독성 및 생체 위해성이 낮은 물질이며, 식품, 의약, 위생 산업 등 다양한 분야에서 안전성이 확보된 제제 개발이 가능하다는 점에서도 높은 응용 가치를 지닌다. Daucosterol은 1,000 μM의 고농도에서도 생장에는 영향을 미치지 않았으므로 항생제 내성 유발 가능성이 낮고, 생체 적용에 있어서도 독성의 우려가 낮다. 또한 daucosterol은 생물막 형성 억제뿐만 아니라 이미 형성된 생물막에 대해서도 약 71.08%(p<0.001)의 분해 효과를 보였으므로 이는 기존 천연물 유래 생물막 제어제들과 비교하여도 매우 높은 수준의 효능으로 평가된다. 대부분의 천연물은 생물막 형성 초기에 작용하는 경우가 많으며, 성숙된 생물막의 구조적 안정성에 영향을 미치기 어려운 반면, daucosterol은 형성 억제와 분해라는 이중 작용기전을 통해 더욱 효과적인 생물막 제어가 가능함을 시사한다. 이와 같이 daucosterol은 기존 생물막 억제제와 명확한 차별성과 우수성을 갖춘 생물막 제어 물질로서의 이용 가치가 높다고 판단된다.
요약 및 결론
본 연구에서는 대표적 식중독균 중 하나인 S. aureus 에 대한 천연물질의 생물막 형성 억제능을 평가하였다. 천연물질 라이브러리 스크리닝을 통해 우수한 생물막 형성 억제 능력이 확인된 daucosterol을 선별하였으며, 이를 활용하여 항균 효과 및 생물막 분해능에 대한 정량적 분석을 수행하였다. 다양한 농도의 daucosterol을 대수기의 S. aureus 에 처리한 결과, 1,000 μM에서도 생장이 저해되지 않는 것으로 나타났다. Daucosterol의 농도별 처리에 따른 생물막 형성 억제 효과를 분석한 결과, 200 μM 이상의 농도에서 유의적으로 형성이 억제되는 것이 관찰되었다. 형성된 생물막에 daucosterol 처리 시, 약 71.08%의 생물막이 감소되어 통계적으로 유의한 수준의 생물막 분해 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 daucosterol이 S. aureus 의 생장은 저해하지 않으면서 생물막 형성을 저해하고 생물막을 분해하는 천연물질임을 시사한다. 따라서 기존 항균제와는 달리 내성 유발 가능성이 낮아, 식중독균 제어를 위한 안전한 대체 전략으로서의 활용 가능성을 보였다. 본 연구를 통해 발굴된 daucosterol은 식품 제조 및 유통 공정에서 적용 가능성이 있는 보존료 또는 세척제 성분으로서의 산업적 응용 가치가 충분한 소재로 판단된다. 다만, 본 연구는 in vitro 조건에서 수행되었기 때문에 실제 식품 매트릭스 및 생체 환경에서의 유효성 및 안전성에 대한 추가적인 검증이 요구된다. 따라서 향후 연구에서는 다양한 식품 유형 및 in vivo 시스템을 기반으로 daucosterol의 안정성, 독성, 흡수 및 분해 특성 등을 종합적으로 평가할 필요가 있다. 또한 다양한 식중독 유발 미생물을 대상으로 한 항균 및 생물막 억제 효과에 대한 확장된 검증을 통해, daucosterol의 적용 범위와 실질적 유용성을 보다 명확히 할 수 있을 것이다. 결론적으로, 본 연구는 daucosterol이 식품 유래 병원균의 생물막을 효과적으로 제어할 수 있는 천연물 유래 후보물질임을 규명하였으며, 이는 향후 식품안전 관리 및 위생 체계 내에서의 적용 가능성을 제시하는 중요한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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